RASopathien sind eine Gruppe von seltenen, genetisch bedingten Erkrankungen, in der verschiedene Krankheitsbilder zusammengefasst werden. Gemeinsam ist ihnen, dass in den Körperzellen ein bestimmter Signalweg (der sogenannte RAS-MAPK-Signalweg) aufgrund von Veränderungen in verschiedenen Genen überaktiviert ist. Die Erkrankungen sind durch Wachstums- und Entwicklungsstörungen, Herzfehler, Skelettanomalien, einer erhöhten Neigung zur Tumorentwicklung, Anomalien der Haut und Haare und variable andere Organanomalien gekennzeichnet. Beispielsweise kommt es bei dem sogenannten Noonan-Syndrom zu einer Verdickung des Herzmuskels (hypertrophe Kardiomyopathie), was für eine erhöhte Sterblichkeitsrate verantwortlich ist. Ziel des Verbundes ist es daher, die Pathogenese und Pathophysiologie der RASopathien detaillierter zu analysieren und so neue therapeutische Ansatzpunkte zu erforschen. In diesem Vorhaben sollen sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von Patientinnen und Patienten generiert und analysiert werden. Diese iPSC werden in ein 3D-Modell des Herzmuskels umgewandelt, so dass daran Langzeituntersuchungen vorgenommen werden können. Diese Ergebnisse können anschließend mit klinischen Parametern in Zusammenhang gebracht werden und neue Zusammenhänge aufklären. Zudem werden weitere biochemische und molekularbiologische Untersuchungen an den Modellen dazu führen, die Krankheitsentstehung und deren zugrundeliegenden Mechanismen besser zu verstehen. Des Weiteren werden erste Testungen zur Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten durchgeführt. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, neue therapeutische Ansatzpunkte zu identifizieren und somit die Behandlung Betroffener zu verbessern.

RASopathien sind eine Gruppe von seltenen, genetisch bedingten Erkrankungen, in der verschiedene Krankheitsbilder zusammengefasst werden. Gemeinsam ist ihnen, dass in den Körperzellen ein bestimmter molekularer Signalweg (der sogenannten RAS-MAPK-Signalweg) aufgrund von Veränderungen in verschiedenen Genen überaktiviert ist. Die Erkrankungen sind durch Wachstums- und Entwicklungsstörungen, Herzfehler, Skelettanomalien, einer erhöhten Neigung zur Tumorentwicklung, Anomalien der Haut und Haare und variable andere Organanomalien gekennzeichnet. Neurokognitive Defizite und die Herzerkrankung sind dabei wesentlich für die langfristige Morbidität verantwortlich. Ziel des Verbundes ist es, die Pathogenese und Pathophysiologie der RASopathien detaillierter zu analysieren und so neue therapeutische Ansatzpunkte zu erforschen. In diesem Vorhaben wird ein neues zelluläres Modellsystem entwickelt, dass die neurobiologische Charakterisierung der genetischen Veränderungen bei RASopathien ermöglicht. Dafür werden sogenannte induzierten pluripotente Stammzellen von Patientinnen und Patienten zu bestimmten Nervenzellen umgewandelt, die dann in Kultur gewebeähnliche Strukturen ausbilden, sogenannte zerebrale Organoide. Diese werden mit verschiedenen Verfahren detailliert analysiert. So sollen molekulare und zelluläre Veränderungen identifiziert werden, die die Ursachen für die Erkrankungen bilden. Somit werden Grundlagen für mögliche neue Therapieansätze geschaffen.

In diesem Teilprojekt soll eine innovative molekulargenetische Diagnostik für RASopathien mittels Hochdurchsatz-Verfahren entwickelt, Zusammenhänge zwischen bestimmten Genveränderungen und Krankheitsverlauf/ -prognose systematisch untersucht und eine spezialisierte Struktur zur Patientenversorgung im Sinne eines nationalen Referenzzentrums am Standort Magdeburg weiter ausgebaut werden. Das Teilprojekt wird als koordinierendes Projekt mit den anderen Teilprojekten des Verbundes eng vernetzt sein und stellt durch den unmittelbaren Bezug zu betroffenen Patienten für den Verbund eine wichtige Plattform für seine translationale Ausrichtung dar. Es soll eine auf modernster „Next-Generation-Sequencing"-Technologie basierende Multi-Gen-Panel-Diagnostik für RASopathien entwickelt und validiert werden, welche die schnelle und kosteneffiziente Analyse aller bekannten RASopathie-Gene erlaubt. Die existierende Online-Mutationsdatenbank (www.nseuronet.com), die von der Arbeitsgruppe im Rahmen eines zurückliegenden E-RARE-Projekts aufgebaut wurde, soll aktualisiert, erweitert und mit neuen Software-Tools ausgestattet werden. Diese ermöglichen Studien zu Mutationsspektren und Genotyp-Phänotyp-Beziehungen auf der Basis standardisierter Daten und in Kohorten bisher nicht erreichter Größe. Unter Einbeziehung einer interdisziplinären RASopathie-Sprechstunde soll am Universitätsklinikum Magdeburg ein nationales Referenzzentrum für RASopathien als Teil des Mitteldeutschen Kompetenznetzes für Seltene Erkrankungen (MKSE: www.mkse.ovgu.de/Fachzentren) weiter ausgebaut werden

In diesem Projekt werden genetisch veränderte Mäuse mit gezielten, aus RASopathie-Patienten bekannten Mutationen eingesetzt um die Auswirkungen veränderter RAS-MAPK Signale auf die Hirnfunktion zu untersuchen. Ziel ist es, diese Mausmutanten als Tiermodelle für kognitive Störungen in RASopathien zu etablieren, die es erlauben werden neue pharmakologische Therapeutika zu testen. In diesem Teilprojekt werden Tiermodelle mit spezifischer aus RASopathien bekannter Mutation in Nervenzellen erzeugt und umfassend molekular, zellulär-physiologisch und verhaltenspharmakologisch charakterisiert. Mit neuronalen Primärkulturen und akuten Schnittpräparaten werden mögliche Veränderungen in neuronaler Differenzierung, Transmission und Plastizität untersucht. So sollen zelluläre Prozesse und molekulare Signalwege, die von der jeweiligen Mutation betroffen sind, identifiziert und Möglichkeiten für eine pharmakologische Intervention auf Synapsen- und Transkriptionsebene eruiert werden. Parallel dazu werden Veränderungen in motorische Fähigkeiten, emotionalem und sozialem Verhalten sowie kognitiven Prozessen analysiert. Durch einen Vergleich verschiedener Mutationen sollen dabei übergeordnete Störungen des Signalwegs und selektive Effekte einzelner Signalwegkomponenten differenziert und bezüglich ihrer Bedeutung für die neuronale Dysfunktion analysiert werden. Diese Mausmutanten werden als Modelle für präklinische Forschung der RASopathien validiert und das therapeutische Potenzial von pharmakologischen Modulatoren des RAS Signalwegs wird auf zellulärer und Systemebene eruiert.

Bei den RASopathien handelt es sich um eine Gruppe von seltenen genetisch bedingten Erkrankungen, die unter anderem das Noonan-Syndrom und die Neurofibromatose Typ 1 umfasst (beide mit einer Häufigkeit von etwa 1:3000). In dem Verbund des Deutschen Netzwerks für RASopathie-Forschung (German Network for RASopathy Research, GeNeRARe) haben sich die besten Forschungsgruppen auf diesem Gebiet sowohl aus den Bereichen der Grundlagenforschung als auch der klinischen Forschung zusammengeschlossen. GeNeRARe hat sich zum Ziel gesetzt, in einem interdisziplinären Ansatz Lücken im bisherigen Wissen über die Pathogenese und Pathophysiologie der RASopathien zu schließen und so neue therapeutische Ansatzpunkte zu erforschen. Durch einen multimodalen und translationalen Ansatz wird als wichtigste Ergebnisse des Gesamtvorhabens eine Verbesserung der klinischen und molekulargenetischen Diagnosestellung, eine präzisere Klassifikation der verschiedenen Erkrankungen und individuelle Risikoprognose, eine Vertiefung der Erkenntnisse über molekulare Mechanismen und deren mögliche Beeinflussbarkeit durch pharmakologische Substanzen und damit die Vorbereitung präklinischer und klinischer Therapiestudien erwartet. In diesem Teilprojekt wird eine klinische Studie durchgeführt, bei der kognitive Leistungen und die synaptische Plastizität nach Einnahme der Medikamente Lamotrigin und Lavostatin evaluiert werden.

Die hypertrophe Kardiomyopathie stellt die wichtigste Ursache für eine erhöhte Mortalität beim Noonan-Syndrom dar. Es ist bekannt, dass die RAS- und RAF1-Signale in Herzmuskelzellen hyperaktiv sind und sehr wahrscheinlich zur Entwicklung hypertropher Kardiomyopathie beitragen. Die Entschlüsselung neuer funktionaler Kontrollmechanismen, die Stärke, die Effizienz und die Spezifität der Signaltransduktion feinregulieren, und die Definition neuer Zielstrukturen sind nicht nur fundamental von großer Bedeutung sondern auch essentiell für die rationale Entwicklung hochselektiver Pharmaka, welche die RAS-Signaltransduktion abschwächen, aber nicht vollständig inhibieren. Die Düsseldorfer Teilprojekte haben folgende Ziele: (TP4-i) Eine detaillierte Charakterisierung der Auswirkungen nicht-konventioneller Klasse-A-RAS-Mutationen auf die Interaktionsnetzwerke und somit auf die Hyperaktivierung des RAS-MAPK-Signalwegs; (TP4-ii) Mehrstufige in vitro-Rekonstitution der RAS-Membran-Interaktion und -Signaltransduktion auf der Grundlage von RASopathie-relevanter Mutationen an natürlichen und synthetischen Liposomen sowie Nonodiscs; (TP4-iii) Identifikation und strukturell-funktionelle Charakterisierung RASopathie-relevanter akzessorischer Proteine in z. B. HL-1 Kardiomyozyten-Zelllinie; (TP4-iv) Etablierung und quantitative Beobachtung der Aktivierung der RAS-Signalwege mittels fluoreszierenden ERK und AKT in Echtzeit; (TP5-i) Generierung genkorrigierter patientenspezifischer iPSCs mittels der CRISPR/Cas9-Technologie zu Differenzierung von z. B. Kardiomyozyten; (TP5-ii) Funktionelle Charakterisierung der RAS-Signalkaskade in patientenspezifischen Kardiomyozyten; (TP5-iii) Charakterisierung von pathobiochemisch relevanten nativen RAS- und RAF1-Proteom in patientenspezifischen Kardiomyozyten; (TP5-iv) Mechanismus-basierte Charakterisierung RASopathie-relevanter RAS-Interaktionsnetzwerke in patientenspezifischen Kardiomyozyten.

Im Mittelpunkt dieses Teilprojektes steht die Aufklärung der molekularen Veränderungen, welche beim Costello-Syndrom den typischen Hautphänotyp verursachen. Unter Verwendung von  humanen Keratinozytenzelllinien mit Costello Syndrom-typischen Mutationen von kultivierten Hautfibroblasten von Patienten mit Costello-Syndrom bzw. Kardio-Fazio-Kutanem-Syndrom (CFC-Syndrom) sowie von Hautfibroblasten transgener Mäuse mit CFC-typischen Mutationen werden folgende Hauptziele verfolgt:  Mittels immunologischer Methoden soll eine detaillierte (qualitativ und quantitativ) molekulare Charakterisierung der pathophysiologischen Veränderungen in Hautzellen mit RASopathie-assozierten Mutationen erfolgen. Mittels diverser molekularbiologischer Methoden sollen die durch die gegebenen RASopathie-Mutationen veränderten zellulären Signalwege identifiziert werden; insbesondere soll Augenmerk auf die Regulation der Integrin-Proteine gelegt werden. Mittels Massenspektrometrie sollen allfällige neue hautspezifische Signalwege identifiziert und diese auf RASopathie-typische Deregulierung analysiert werden. Es wird ein signifikanter Erkenntnisgewinn hinsichtlich der RAS-abhängigen Regulation der epidermalen Homöostase und der molekularen Pathologie des Hautphänotyps bei RASopathien erwartet. Arbeitsschritte sind: 1. Etablierung der stabilen HaCaT Keratinozytenzelllinien; 2. Charakterisierung der pathophysiologischen Veränderungen in den Keratinozyten und den humanen Hautfibroblasten; 3. Statusfeststellung von den bekannten HRAS-abhängigen Signalwegen in den Keratinozyten; 4. Zuordnung veränderter Signalkaskaden zu Veränderungen in der Zellphysiologie in den Keratinozyten und Hautfibroblasten von Patienten; 5. Identifikation von neuen HRAS-abhängigen Signalwegen in Keratinozyten; 6. Verifikation der neuen Keratinozyten-spezifischen HRAS-Signalwege hinsichtlich Ihrer Relevanz für die Pathophysiologie beim Costello-Syndrom und 7. Ausweitung der Analysen auf Hautfibroblasten von Patienten mit CFC und von transgenen Mäusen.

HRAS-Keimbahnmutationen verursachen eine Entwicklungsstörung namens Costello-Syndrom (CS, G12-Mutationen > 80%). Erwachsene CS-Patienten scheinen einen Phänotyp der vorzeitigen Alterung aufzuweisen. Onkogene HRAS-G12V Mutationen führen zu einer Onkogen-induzierten Seneszenz (OIS). Demnach könnte die zelluläre Seneszenz ein kritischer Faktor in der Förderung von vorzeitigem Altern und Krebs darstellen. In diesem Sinne ist es notwendig, OIS in einem Mausmodell zu validieren, den in CS-Patienten festgestellten Phänotyp der vorzeitigen Alterung zusammenzufassen und schlüssig nachzuweisen, sowie die wichtigsten Proteine und Signalwege aufzudecken, die im vorzeitigen Altern und in der altersbedingten Tumorigenität involviert sind. Zur Belegung dieser Hypothese verwenden wir ein CS-Mausmodell mit einer HRAS-G12V Keimbahnmutation. Wildtyp- und primäre CS-Fibroblasten werden auf Seneszenz, Proliferation, Apoptose, Zellzyklusarrest und DNA-Schäden untersucht. Zudem wird eine Untersuchung der Fibroblasten auf RAS-MAPK- und RAS-AKT-Aktivierung und auf Expression rational ausgewählter Targetgene (z.B. c-Myc) erfolgen. Als Nächstes werden die in Primärzellen festgestellten biologischen Prozesse in den von CS-Mäusen entnommenen Organen, Geweben und Tumoren nachgeprüft. Falls keines der Targetproteine eine differentielle Expression zwischen normalen Geweben und Tumoren zeigt, wird eine Genexpressionsanalyse durchgeführt zur Identifizierung neuer Targets, die das Seneszenz-Proliferation-Gleichgewicht beeinflussen könnten. Schließlich soll gezeigt werden, dass OIS ein Auslöser des vorzeitigen Alterns im CS-Mausmodell ist. Dazu werden die Lebensdauer, Krebsinzidenz, externe Morphologie, Gewebeanomalien, Tumoren und Verteilung der Alterung/Seneszenz-Marker beobachtet. Zum Abschluss der Analyse der jungen/alten CS-Mäuse wird eine Testung auf RAS-MAPK- und RAS-AKT-Aktivierung, der Regenerationsfähigkeit (Wundheilung der Haut), sowie eine vergleichende Genexpressionsanalyse stattfinden.