Standort MPI, Dresden: Entwicklung, Validierung und Anwendung von RNA-Interferenz für Hochdurchsatz-Screening und Genfunktionsanalysen in Mausembryonen
Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie |
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Ziel dieses Teilprojektes der SMP RNAi ist es, die esiRNA-Technologie weiter zu entwickeln und diese für Hochdurchsatz RNAi-Screens in menschlichen Zelllinien zu testen. Ziel ist es zudem, die in den RNAi-Screens identifizierten Gene zu validieren und weiter funktionell zu charakterisieren, indem diese mit GFP und anderen TAGs markiert und stabil in menschlichen Zelllinen als BAC-Transgene exprimiert werden. Weitere Ziele sind, die Technik der gewebespezifischen RNAi in postimplativen Mausembryonen zu standardisieren und die zeitlichen Beschränkungen bei der Aufbringung exogener RNAs auf die Ganzembryokultur zu überwinden. Um obige Ziele zu erreichen, werden die Protokolle zur esiRNA-Generierung verbessert, Maus-BACs über ET-cloning modifiziert und in humane Zellen stabil integriert und die in-utero-Injektion und Elektroporation von esiRNAs etabliert. Die Ergebnisse sollen die Identifizierung von krankheitsrelevanten Genen beschleunigen, die im Anschluss validiert werden sollen. Identifizierte und validierte Gene sollen in vivo im Mausembryo untersucht werden. Nach der Überprüfung der Patentierbarkeit sollen die Ergebnisse publiziert werden.
Standort EMBL, Heidelberg: Genomweite RNAi-Screens mittels Zellchips
Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) - Gene Expression Programme |
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Ziel dieses Vorhabens ist die Entwicklung und Anwendung von genomischen RNA-Interferenz-Screens im Hochdurchsatz in kultivierten menschlichen Zellen. Durch den Einsatz dieser Methode sollen Gennetzwerke identifiziert werden, die für zentrale biologische Prozesse verantwortlich sind und die die Basis zum Verständnis molekularer Ursachen menschlicher Krankheiten bilden. Arbeitsablauf: 1. Festphasentransfektion von RNAi. 2. Konfokale Screening-Mikroskopie. 3. Optimierung und Prodkuktion von RNAi-Zell-Chips. 4. Zelluläre Hochdurchsatz-Assays 5. Entwicklung von LIMS. 6. genomweite RNAi-Screens in menschlichen Zellen. 7. Tagging von Genen in Zelllinien beim Kooperationspartner (MPI-CGB). Die entwickelte optische Technologie soll mit führenden Mikroskopherstellern zur Produktreife gebracht und vermarktet werden. Die Methode des RNAi-Hochdurchsatz-Screenings soll mit dem Partner Cenix als Service angeboten und vermarktet werden. Gene, deren Beteiligung an Krankheitsprozessen nachgewiesen wurde, werden patentrechtlich geschützt und sollen auf ihre Tauglichkeit zur Wirkstoffentwicklung, ggf. in Zusammenarbeit mit Biotechnologie-Unternehmen, untersucht werden. Weiterhin sollen die Ergebnisse veröffentlicht werden.
Standort GSF, Neuherberg: RNAi-in-vivo-Technologieentwicklung und ihr Einsatz im adulten Maussystem zur Erzeugung von Krankheitsmodellen
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH |
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Ziel des Teilvorhabens ist die Entwicklung der RNA-Interferenztechnologie für eine standardisierte in-vivo-Anwendung in größerem Maßstab und die Anwendung der etablierten Technologie zur Erzeugung von adulten Mausmodellen menschlicher Krankheiten. Es werden unterschiedliche technologische Ansätze (Injektion nackter, interferierender RNA in adulte Mäuse, Injektion von interferierende RNA-tragenden Lentiviren in adulte Mäuse sowie shRNA-Vektor-transgene Mäuse) etabliert und miteinander verglichen. Die effizienten RNAi-Technologieansätze werden zur Erstellung von Mausmodellen für neurologische und psychiatrische Erkrankungen (Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Depression), für Krebs und für andere Krankheiten eingesetzt. Die Ergebnisse sollen zur Etablierung einer standardisierten RNAi-in-vivo-Technologie beitragen, mithilfe derer im adulten Maussystem eine Vielzahl menschlicher Krankheiten modelliert werden kann. Die Ergebnisse werden auf Patentierbarkeit hin überprüft und veröffentlicht.
Standort MPI, Berlin: Gen-"knock down" in der Maus: High-throughput-Funktionsanalyse von Genen bei Signalmechanismen in Entwicklungs- und Krankheitsprozessen sowie Analyse von transkriptionsregulatorischen Netzwerken
Max-Planck-Institut für molekulare Genetik |
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Ziel des Vorhabens ist es, a) regulatorische Netzwerke unterhalb der Wnt/b-cat-, FGF- und TGFb1/BMP-Signalketten, die wichtige Rollen in der Entwicklung und bei Krankheiten spielen, im Detail zu ergründen. Dabei soll die Rolle dieser Signalketten in der Embryonalentwicklung, insbesondere beim epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT), der auch bei der Metastasierung von Tumoren eine entscheidende Rolle spielt, im Mittelpunkt des Interesses stehen. Zudem sollen b) für 150 Transkriptionsfaktoren genregulatorische Netzwerke durch "knock down"-Experimente und anschließende Expressionsanalysen ermittelt werden, um Krankheitsprozesse besser zu verstehen. Mittels Vector-basierender RNA-Interferenztechnologie, die als "high-throughput"-Mutagenesemethode eingesetzt wird, werden ausgewählte Gene während der Organogenese im Mausembryo bzw. ausgewählte Transkriptionsfaktoren in Zellkulturen durch "knock-down" inaktiviert. Die Zellkulturen und mutierten Embryonen werden mittels "expression profiling" auf genetische Veränderungen hin untersucht. Morphologische Besonderheiten der Embryonen werden analysiert und whole-mount in-situ-Hybridisierungen durchgeführt. In Kombination mit Expressionsstudien (Partner: SMP "RNA"), Promoter- (Partner: SMP "DNA") und in-silico-Analysen sollen regulatorische Netzwerke erstellt werden. Die identifizierten Gene und regulatorischen Netzwerke, die bei der Entstehung menschlicher Erkrankungen eine Rolle spielen, sollen patentiert und publiziert werden.
Standort DKFZ, Heidelberg: Automatisierte Zell-Phänotypisierung und Datenbank
Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) |
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Ziel dieses Vorhabens ist der computergestützte Support aller Aktivitäten innerhalb der SMP "RNAi". Dieser Support wird die Bildanalyse und -klassifikation für die automatisierte Bilderfassung und Zell-Phänotypisierung umfassen. Ein weiterer Fokus wird die Implementierung einer RNAi-Phänotypdatenbank sein. Die Entwicklung der Bildanalyseverfahren und die Integration der automatisierten Workflows für die Bilderkennung werden in Zusammenarbeit mit den anderen Projektpartnern geschehen. Die Phänotypendatenbank wird basierend auf der Expertise in der Hyman-Gruppe und der Firma Cenix implementiert. Allgemeine Workflows zur Bilderkennung von RNAi-Phänotypen und zur Korrelation dieser Phänotypen mit anderen molekularen und klinischen Daten werden entwickelt und allen Partnern zur Verfügung gestellt. Die Informatikplattform wird auch für Serviceprojekte der Firma Cenix von großer Relevanz sein, was eine Basis für den Methodentransfer unter zu definierenden Lizenzbedingungen ist. Alle in der SMP "RNAi" generierten Daten werden nach zu definierenden Regeln der Öffentlichkeit über unsere Datenbank zugänglich gemacht, was eine Basis für eine direkte Verwertung der Ergebnisse dieses Konsortiums ist. Neben möglichen Patenten werden auch Publikationen angestrebt.
Entwicklung und Produktion einer neuartigen RNAi Screening Bibliothek sowie Entwicklung und Service der RNAi Plattform
Cenix BioScience GmbH |
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Standort RiNA GmbH, Berlin: Networking, Training und Workshops für NGFN-2-Teilnehmer im Bereich RNAi-Forschung
Rina-Netzwerk RNA Technologien GmbH |
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Die RNAi-Technologie zeigt eine rasche Entwicklung und hat einen enormen Einfluss auf viele Forschungsprojekte, insbesondere aus dem Bereich "Funktionelle Genomik". So wird ein großer Teil von NGFN-2-Teilnehmern die RNAi-Technologie in ihren Vorhaben einsetzen wollen. Unsere Erfahrungen zeigen, dass für die Planung und Durchführung von RNAi-Experimenten ein Informationsaustausch, Diskussionsmöglichkeiten und praktische Laborkurse außerordentlich hilfreich sind. Ziel des Vorhabens ist die Schaffung eines Kommunikations-Netzwerkes, um Synergien zu ermöglichen durch Informationsaustausch innerhalb des SMPs, mit anderen NGFN-2-SMPs sowie mit weiteren Organisationen, wie den etablierten Netzwerken, RNA-Technologien und EURIT. Dieses Ziel soll mit der Durchführung von Laborkursen für Anwender von RNAi-Technologien im NGFN-2, der Organisation von Konferenzen und Workshops als Informations- und Diskussionsforum sowie der Schaffung einer Internet-Plattform erreicht werden.