Zunächst werden eine anatomische Landkarte des Neuronen-spezifischen DNA-Methyloms in Einzelbasen-Auflösung sowie das microRNA Profil für das gesunde menschliche Hirn in Alters- und Geschlechts-definierten Gruppen als Referenz-Ressource erstellt. Dann sollen Veränderungen im DNA-Methylom und microRNA Profil in Neuronen von Parkinson Hirnen identifiziert werden. Effekte der Parkinson-spezifischen epigenomischen Veränderungen auf die Genexpression in menschlichen Hirnen werden untersucht. Die Anwesenheit der Parkinson-spezifischen epigenomischen Veränderungen im Blut von Patienten werden ebenfalls untersucht, um mögliche Biomarker zu identifizieren. Weiterhin werden das Vorhandensein und die funktionelle Bedeutung der Parkinson-spezifischen epigenomischen Veränderungen in kultivierten Neuronen aus induzierbaren pluripotenten Stammzellen (IPS) von Patienten und Kontrollen, sowie aus primären humanen Vorläuferzellen analysiert, um deren Bedeutung als primäre Krankheitsursachen oder sekundäre Krankheitskonsequenzen zu differenzieren. Neben der Koordination der Arbeit des gesamten Konsortialprojektes wird der letztgenannte Aspekt der wesentlich Fokus des Teilprojektes sein.

Das Teilprojekt 3 gliedert sich in fünf Unterprojekte (3.1-3.5). Im Rahmen der fünf Unterprojekte werden humane post-mortem Gewebeproben unterschiedlicher Hirnregionen von gesunden Kontrollpersonen mit Proben von Patienten mit Parkinsonerkrankung verglichen. 3.1 beschäftigt sich mit Proben von gesunden Kontrollfällen, 3.2 mit Proben von Parkinsonpatienten, 3.3 ergänzt weitere Regionen von Parkinsonpatienten, um regionale Verteilungsmuster zu erkennen, 3.4 beschäftigt sich mit Parkinsonpatienten in sehr frühen Stadien um das Voranschreiten der Erkrankung beobachten zu können und in 3.5 sollen Validierungen der Ergebnisse erfolgen. Die Daten der Unterprojekte 1-5 werden korreliert, so dass epigenetische Veränderungen bei Voranschreiten der Parkinsonerkrankung zu erkennen sind. Hierbei werden DNA-Modifikationen (Methylierung, Hydroxymethylierung) und Transkriptomveränderungen untersucht. Zur Anwendung kommen (hydroxy)methylierungs-sensitive Sequenziertechniken (Next Generation Sequencing) sowie RNA-Seq.

Ziel des Projektes ist die Untersuchung und Validierung epigenetischer Modifikationen die bei der Entstehung der Parkinson Krankheit eine Rolle spielen. 5` Methylierung und Hydroxymethylierung von Cytosin sind epigenetische DNA Modifikationen, die besonders wenn das modifizierte Cytosin Teil einer CpG Insel ist, die Expression verschiedener Gene beeinflussen. Ebenso kommt miRNAs eine wichtige Rolle bei der Expression von Zielgenen zu, wobei die Effekte von miRNAs durch epigenetische Modifikation ihrer eigenen Expression moduliert werden. Es soll zunächst eine umfassende Karte des DNA-Methyloms und miRNA-Profils in Alters- und Geschlechts-stratifizierten Gehirnen von  Kontrollen erfolgen. Dann werden Methylom und miRNA Profile an Gehirnen von Parkinson-Patienten untersucht und mit den Kontrollen verglichen. Die Expression von abnorm methylierten Genen wird durch quantitative PCR untersucht. Die Arbeitsplanung sieht vor zunächst ein miRNA-Profil ausgewählter Gehrinregionen von Patienten und Kontrollen zu erstellen. Methylierungsunterschiede in Gehirnen von Parkinson Patienten, die im Labor durch Sequenzierung Bi-Sulfit-konvertierter DNA erfasst wurden, werden in diesem Teilprojekt durch Pyrosequenzierung verifiziert. Anschließend wird die Expression von den Genen, bei denen Methylierungsunterschiede bestätigt wurden, durch quantitative  PCR untersucht. Außerdem wird die Expression von Genen quantitativ untersucht, die von miRNAs kontrolliert werden, deren Expression in "Parkinson-Gehirnen" verändert ist. Gene, die eine durch DNA-Methylierung oder miRNA-Regulation veränderte Expression in Parkinson Patienten aufweisen, werden weiter funktionell untersucht. Insbesondere soll die Menge und Verteilung von Proteinen mittels Western Blotting und Immunhistochemie analysiert werden.

Die Parkinson-Krankheit (PK) wird durch eine Kombination von genetischer Prädisposition und Umwelt-Faktoren ausgelöst. Ein besonders wichtiger Umweltmechanismus könnte die Modifikation der Genexpression durch epigenetische Faktoren, einschließlich der DNA-Methylierung, darstellen. Veränderungen des DNA-Methyloms und das microRNA-Profil sollen daher in Neuronen und Gliazellen, die von Patienten mit sporadischer PK und gesunden (Kontroll-) Geschwistern abgeleitet wurden, untersucht werden. Dabei sollen Zell-Modelle entwickelt werden, um funktionellen Konsequenzen spezifischer epigenomischer Veränderungen in PK zu studieren (zusammen mit TP 3 und 4). Die im Verbund in post-mortem Gehirnen von PK Patienten identifizierten Veränderungen werden hier funktionell charakterisiert. Der Arbeitsplan sieht vor, zunächst iPS -Zellen von drei diskordanten Geschwisterpaaren (mit/ohne PK) zu erzeugen. Hierzu werden nicht integrierende Sendai-Virus-basierte Vektoren, die die zur Umprogrammierung erforderlichen Faktoren OCT3/4, SOX2 , Klf4 und cMYC kodieren, verwendet (Koch et al., Nature 2011 480: 543 -6). Es folgt eine neuronale Differenzierung und Untersuchung der hiermit mutmaßlich verbundenen epigentischen Veränderungen. Die sich anschließenden Funktionsanalysen werden in Zusammenarbeit mit TP4 und 6 durchgeführt. Dabei werden auch die Wirkungen der für die Behandlung der PK eingesetzten Medikamente, insbesondere von L-Dopa, Dopamin -Agonisten und Monoaminooxidase (MAO) -B -Inhibitoren geprüft. In einem weiteren Ansatz wird die Wirkung exogenen Alpha-Synuclein Proteins auf neuronal differenzierte Stammzellen untersucht, um herauszufinden, ob die beobachteten Veränderungen in TP1 und 2 bei PK-Patienten sekundär zu Alpha-Synuclein Exposition auftreten.