Hauptziele des Teilprojektes 3 sind die 1) Identifizierung von elementaren Virus-Wirt Protein Interaktionen (PPIs) für ein potenziell auftretendes, neues Virus, welche auch für andere neu auftretende Viren ("emerging viruses", EAs) relevant sind. Als Modell dient das MERS-CoV. Aufgrund des gegenwärtigen, unerwarteten COVID-2 Ausbruches werden die Ansätze auf SARS-CoV-2 angewendet. 2) Entwicklung von Kriterien für virale Virulenz und epidemische Risiken auf der Basis molekularer Proteininteraktionen. 3) Entwicklung von schnell verwendbaren Y2H (yeast-2-hybrid) Siebverfahren ("screening") auf der Basis spezifischer zellulärer, für die virale Replikation benötigter Kontrollpunkt ("checkpoint") Gene/Proteine. Dieser systembiologische Ansatz komplementiert den Anspruch des Konsortiums auf die Risikobeurteilung durch präpandemische Agentien über die Identifizierung zellulärer Barrieremarker auf Proteinebene.

Das Spike-Protein (S) des Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) vermittelt das Eindringen des Virus in Zellen. Dazu muss das MERS-CoV S-Protein (MERS-S) von Proteasen der Wirtszelle aktiviert werden, ein Prozess bei dem die Serinprotease TMPRSS2 eine wichtige Rolle spielt. Im Rahmen dieses Projektes soll untersucht werden, in wie weit die Effizienz der Aktivierung von MERS-S durch TMPRSS2 die Übertragbarkeit und das pathogene Potenzial von MERS-CoV-Isolaten vorhersagen kann. Es wurden im Projekt Hinweise darauf erhalten, dass MERS-CoV-Varianten aus Patienten Aminosäureaustausche im Spike-Protein tragen können, die die Aktivierung durch TMPRSS2 verstärken. In der zweiten Förderphase soll geklärt werden, ob die verstärkte Aktivierung durch TMPRSS2 mit einer erhöhten Replikation im respiratorischen Epithel bzw. erhöhten pathogenen Potenzial einhergeht. Diese Untersuchungen sollen schließlich auf MERS-CoV-Varianten ausgedehnt werden, von denen Verbundpartner zeigen konnten, dass sie interessante biologische Eigenschaften aufweisen.

Typ I-Interferone (IFN-alpha/beta) und andere Zytokine stellen die erste Verteidigungslinie gegen virale Infektionen dar. IFN aktiviert die Expression von mehr als 300 sogenannten ISGs (IFM-stimulated genes), von denen einige in der Lage sind, Viren direkt zu hemmen. Pathogene Viren verhindern oft die Induktion des IFN, blockieren das von IFN ausgelöste Signalling oder inaktivieren gezielt einzelne ISGs. Zudem können sie die Induktion pro-inflammatorischer Zytokine auslösen. Die Qualität und Stärke der IFN- und Zytokin-Induktion, IFN-Evasion und IFS-Sensitivität, zusammen als Innate Immunity-Phänotyp bezeichnet, ist ein wichtiger Virulenzmarker. Ziel dieses Teilprojektes ist es, Systeme für die Erfassung des Innate Immunity-Phänotyps prä-pandemischer respiratorischer Viren zu etablieren, um eine schnelle Risikoeinschätzung vornehmen zu können. Hierfür wird die Aktivierung von Zytokinen (inkl. IFN) und antiviralen ISGs gemessen und für jedes untersuchte Virus ein IFN-Sensitivitätsprofil erstellt. Zudem wird eine Bibliothek an ISG-exprimierenden Zell-Linien generiert, um spezifische ISG-Resistenzen bzw. Sensitivitäten aufzudecken.

Das Teilprojekt TP7 des RAPID-Verbundes entwickelt ein Infektionsmodell in explantiertem humanem Lungengewebe zur Bestimmung von Korrelaten der Virulenz und Verbreitungsfähigkeit präpandemischer Atemwegsviren. Anhand eines prototypischen hochpathogenen aviären Influenza A Virus (H5N8) wurde gezeigt, dass virale Vermehrungsfähigkeit direkt mit im Frettchenmodell projiziertem zoonotischen Potenzial korreliert. Dies sind wichtige Referenzdaten für das Modell, da es für MERS kein dem Frettchen gleichwertiges Tiermodell gibt. Geplant ist die Charakterisierung von Zytokin-assoziierten Signalübertragungswegen, die von zirkulierenden MERS-CoV aktiviert werden und ggf. mit selektiver Vermehrungsfähigkeit assoziiert sind. Technisches Ziel ist die Etablierung von Lungenorganoiden auf Basis adulter Stammzellen aus primären humanen Lungen als standardisiertes und ad hoc verfügbares Infektionsmodell für MERSCoV. Hierzu müssen die Organoide im Vergleich zu Primärmaterial charakterisiert werden. In Zusammenarbeit mit TP3 soll die Rolle von ER-assoziierten Cyclophilinen A und B sowie p53 für die intrazelluläre Replikation von CoV in humanen Lungen geklärt werden. Weiteres technisches Ziel ist die dauerhafte Etablierung der entwickelten Risikoabschätzungsmethodik am Konsiliarlabor für Coronaviren (Charité) und am Nationalen Referenzzentrum für Influenza (RKI).

In diesem Projekt sollen Studien zur Evaluierung der Immunogenität und Schutzwirkung von MVA-MERS-S Impfungen im Kamel durchgeführt werden. Dabei sollen optimale Immunisierungsschemata im Kamel identifiziert werden, die effizient die Ausscheidung von MERS-Cov durch das Kamel unterbinden. So soll die MERS-Übertragung von Kamel auf Mensch verhindert werden.

Diese Vorhabenbeschreibung fasst die Arbeiten von TP1, TP6 und TP7 zusammen. Die Phänotypen bereits sequenzierter und isolierter oder revers-genetisch hergestellter Varianten des MERS-Coronavirus aus vergangenen Ausbrüchen werden in unterschiedlich komplexen in vitro-Kulturmodellen untersucht. Dazu werden Zelllinien (TP1), Atemwegsepithel (TP6) und Lungengewebe (TP7) menschlichen Ursprungs mit Virusvarianten infiziert und deren Phänotypen bestimmt. Es sollen genetische virale Marker und zelluläre Antworten auf die Infektion bestimmt werden, die sich eignen, das pandemische Potenzial neuartiger respiratorischer Viren zu beurteilen. Zusätzlich werden Zelllinien und Atemwegsepithel mit ausgeschaltetem oder herunterreguliertem Interferonsystem generiert, die zur verbesserten Virusisolierung verwendet werden sollen. In den Zelllinien wird hierzu das CRISPR/Cas9-System und im Atemwegsepithel der shRNA-vermittelte knock-down angewandt. Ein revers-genetisch hergestelltes MERS-Coronavirus, das nur noch über unzureichende Korrekturlesefähigkeiten verfügt und deshalb stark attenuiert ist, wird verwendet, um in den genannten in vitro-Kulturmodelle passagiert und adaptiert zu werden. So sollen genetische Marker des Virus bestimmt werden, die zur verbesserten Replikation im Menschen führen. Zusammenfassend soll ein Repertoire an Werkzeugen zur in vitro-Beurteilung des pandemischen Potenzials neuer und neuartiger respiratorischer Viren etabliert werden. Für die Verwendung in einem RNAi-"loss-of-function"-Screening wird ein GFP-exprimierendes MERS-Coronavirus hergestellt.

Ein Grundpfeiler der Pandemie-Präventionsforschung muss Ansätze beinhalten, welche eine Vorhersage über die Kompatibilität von tierischen Viren mit dem menschlichen Wirt erlaubt. Ein umfassender Überblick über die Interaktion des Virus mit für ihn essentiellen Wirtsfaktoren bildet eine solide Basis für das Verständnis der viralen Pathogenese und, resultierend, der Übertragbarkeit zwischen verschiedenen Wirtsspezies. Jüngste RNA-Interferenz-Studien (loss-of-function screens), haben erste Einblicke in die Rolle zellulärer funktioneller Knotenpunkte während der intrazellulären Pathogenreplikation gegeben. Sie bilden den Ausgangspunkt für das geplante Projekt. Studien deuten auf Gemeinsamkeiten hinsichtlich der Infektionsstrategien verschiedener Viren hin. Mit der Entwicklung des CRISPR/Cas9-Systems, das eine sequenzspezifische Abschaltung oder Aktivierung von einzelnen Genen ermöglicht, steht eine weitere leistungsstarke Methode zur Identifikation von viralen Angriffszielen/essentiellen Wirtsfaktoren zur Verfügung. Diese Technologien werden virusspezifisch etabliert und zur Identifikation von zellulären Faktoren verwendet, die für die Replikation von MERS-CoV sowie weiteren neu auftretenden zoonotischen Viren von fundamentaler Bedeutung sind. Die erhobenen Daten werden dann einer systembiologischen Analyse unterzogen und sollen so Einblicke in mechanistische Gemeinsamkeiten und Unterschiede verschiedener Viren liefern.

Hier sollen Studien zur Evaluierung der Immunogenität und Schutzwirkung von MVA-MERS-S Impfungen im Kamel durchgeführt werden. Dabei sollen optimale Immunisierungsschemata im Kamel identifiziert werden, die effizient die Ausscheidung von MERS CoV durch das Kamel unterbinden. So soll die MERS Übertragung von Kamel auf Mensch verhindert werden. Das Zusammenspiel viraler und zellulärer Proteine gibt Hinweise auf für die Virusreplikation essentielle zelluläre Signalwege. Diese Kenntnisse werden genutzt, um eine neue, schnell anwendbare Hefe-2-Hybrid (Y2H) Bibliothek zu entwickeln, welche auf einer humanen "Kern" cDNA Bank mit Vertretern der wichtigsten bekannten, für die Virusreplikation benötigten zellulären Signalwege basiert. Als Testsystem für einen präpandemischen Virusausbruch wird eine virale Y2H Expressionsbank des MERS-CoV konstruiert und verwendet. Von den Proteinwechselwirkungen erwarten wir prädiktives Potenzial hinsichtlich Speziesbarrieren, Pathogenese und möglicher Prävention neu auftretender Erreger.

Das Spike-Protein (S) des Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) vermittelt das Eindringen des Virus in Zellen. Dazu muss das MERS-CoV S-Protein (MERS-S) von einer Protease der Wirtszelle aktiviert werden. Neuere Arbeiten weisen darauf hin, dass die Serinprotease TMPRSS2 eine wichtige Rolle bei der MERS-S-Aktivierung spielt. Im Rahmen dieses Projektes soll untersucht werden, in wie weit die Effizienz der Aktivierung von MERS-S durch TMPRSS2 die Übertragbarkeit und das pathogene Potenzial von MERS-CoV-Isolaten vorhersagen kann. Diesem Ansatz liegt die Hypothese zugrunde, dass sich nur solche MERS-CoV-Varianten robust in Patienten und in der Bevölkerung ausbreiten können, die TMPRSS2 mit hoher Wirksamkeit für ihre Aktivierung nutzen.

Typ I-Interferone (IFN-alpha/beta) und andere Zytokine stellen die erste Verteidigungslinie gegen virale Infektionen dar. IFN aktiviert die Expression von mehr als 300 sogenannten ISGs (IFN-stimulated genes), von denen einige in der Lage sind, Viren direkt zu hemmen. Pathogene Viren verhindern oft die Induktion des IFN, blockieren das von IFN ausgelöste Signaling, oder inaktivieren gezielt einzelne ISGs. Zudem können sie die Induktion pro-inflammatorischer Zytokine auslösen. Die Qualität und Stärke der IFN-und Zytokin-Induktion, IFN-Evasion und IFN-Sensitivität, zusammen als Innate Immunity-Phänotyp bezeichnet, ist ein wichtiger Virulenzmarker. Ziel dieses Teilprojektes ist es, Systeme für die Erfassung des Innate Immunity-Phänotyps prä-pandemischer respiratorischer Viren zu etablieren, um eine schnelle Risikoeinschätzung vornehmen zu können. Hierfür werden die Aktivierung von Zytokinen (inkl. IFN) und antiviralen ISGs gemessen, und für jedes untersuchte Virus ein IFN-Sensitivitätsprofil erstellt. Zudem wird eine Bibliothek an ISG-exprimierenden Zell-Linien generiert, um spezifische ISG-Resistenzen bzw. Sensitivitäten aufzudecken.

Wenn Menschen an einem unbekannten, aus einer Tierquelle stammenden neuen respiratorischen Pathogen wie z. B. dem MERS Coronavirus erkranken, stellen sich eine Reihe von Fragen, die im Rahmen einer schnellen Risikobewertung geklärt werden müssen, um adäquate Ausbruchskontrollmaßnahmen im Public Health Sektor zu initiieren. Dies betrifft insbesondere das Potenzial des neuen Erregers zum Auslösen von schweren Erkrankungen und zur Ausbreitung in der menschlichen Bevölkerung. Zoonotische Übertragungen werden durch initial meist unbekannte Faktoren des Pathogens und des menschlichen Wirts ermöglicht. Erste Untersuchungen und Abschätzungen sollten daher nicht nur das neue Pathogen sondern idealerweise auch menschliche primäre Zellen bzw. Gewebe einbeziehen. Im Fall von MERS CoV gibt es bisher kein adäquates Tiermodell, das die pathophysiologischen Konsequenzen einer Infektion beim Menschen reproduziert. Daher lässt sich derzeit nicht genau abschätzen, wie hoch das relative Virulenzpotenzial der fünf im Tierreservoir zirkulierenden Viruslinien im Menschen ist. Das Projekt hat das Ziel, die innerhalb des Konsortiums vorliegenden MERS CoV-Varianten im etablierten Infektionsmodell mit explantiertem humanen Lungengewebe zu charakterisieren. Die gewonnenen Daten und Erfahrungen sollen beispielhaft zur Etablierung eines Bewertungsschemas für neue respiratorische Viren genutzt werden.

Das Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-Coronavirus (CoV) stellt eine bedeutende Zoonose dar, die bei Kamelen und Menschen vorkommt und Schäden im Respirationstrakt verursacht. Ob Impfungen bei Kamelen erfolgreich eingesetzt werden können, soll untersucht werden. Hierfür werden die MERS-CoV-induzierten Läsionen bei geimpften und nicht-geimpften Tieren verglichen und die pathologischen Veränderungen des Respirationstraktes, die Entzündung und die Virusmenge in den Organen quantifiziert, um einen Erfolg durch die Impfung aufzuzeigen. Darüber hinaus sollen verschiedene Impfschemata bei den Kamelen getestet werden, um eine größtmögliche Effizienz der Vakzinierung zu erreichen. Kamele vor der Virusinfektion zu schützen und damit die Virusausscheidung zu reduzieren, ermöglicht es, die Menschen vor dieser schwerwiegenden, teils tödlich verlaufenden Virusinfektion zu bewahren und somit stellt dieses Projekt einen wesentlichen Teil des sogenannten "One Health"-Ansatzes dar.