Das übergeordnete Ziel diese Projektes ist es, mit Hilfe neuer sowohl klinischer als auch apparativer Messmethoden klinische Ergebnisparameter bei neuronalen Ceroid-Lipofuszinosen zu entwickeln, welche die Bewertung neuer experimenteller Therapien ermöglichen sollen. Teilprojekt 3: Ziel dieses Teilprojektes ist es, 1. Regulationsmechanismen der Genaktivierung bei der CLN3-Erkrankung zu bestimmen; 2. Die Gene zu identifizieren, die aktiviert bzw. deaktiviert werden und wie sie die Funktion der Lysosomen beeinflussen, und 3. die modulierende Wirkung dieser Gene an CLN3-defizienten Zellen zu überprüfen.

Hauptziel des Teilprojektes ist die Entwicklung von diagnostischen Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von lysosomalen Enzymen aus Trockenblut mittels hochspezifischer Tandem-Massenspektrometrie, die Multiplexbestimmungen ermöglicht. Darüber hinaus ist die Entwicklung neuer Verfahren zur direkten Quantifizierung von lysosomalen Proteinen mittels Affinitäts-Massenspektrometrie geplant. Mit diesem Projekt sollen die bisherigen biochemischen diagnostischen Verfahren wesentlich verbessert werden und bei einigen NCLs erstmalig eine biochemische Diagnostik eingeführt werden. Der Arbeitsplan des Projektes gliedert sich in die folgenden Hauptziele: 1. Entwicklung von neuen Substraten für die massenspektrometrische Diagnostik von Neuronalen Ceroid Lipofuscinosen (NCLs) aus Trockenblut, neue Substrate für CLN 1, 2, 10, und 13, (1. Milestone: klinische Validierung der Assays); 2. Entwicklung von Verfahren der Multiplex-Massenspektrometrie: Gleichzeitige Bestimmung der Aktivität mehrer Enzyme aus Trockenblut, (2. Milestone: klinische Validierung der Assays mittels Patientenproben); 3. Entwicklung von Methoden der Affinitäts-Massenspektrometrie für die Konzentrationsbestimmmung von lysosomalen Enzymen und nicht-enzymatischen löslichen lysosomalen Proteinen, (3. Milestone: Validierung des Assays für CLN5 und 10); 4. Konzentrationsbestimmung von CLN5 und 10 (Mausmodell u. Patientenproben, (4. Milestone: Validierung der Assays für Trockenblut und Gewebe).

Bei CLN6 handelt es sich um ein Protein, das in der Membran des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Mutationen im CLN6-Gen führen zu der Erkrankung Neuronale Ceroid Lipofuszinose. Hierbei handelt es sich um eine neurodegenerative lysosomale Speichererkrankung, bei der sich z. B. Proteine und Lipide, die nicht abgebaut werden, in den Lysosomen ansammeln. Die Erkrankung tritt zumeist im Kindesalter auf und führt zu einem fortschreitendem Verlust der geistigen und körperlichen Fähigkeiten, was schließlich zum frühzeitigen Tod führt. Warum eine Mutation von CLN6 zu dieser Erkrankung führt, ist unbekannt. Das Ziel dieses Projektes ist es, neue Interaktionspartner des CLN6 Proteins in der Zelle und speziell in oder an den Lysosomen zu identifizieren. Um weitere Hinweise auf mögliche Krankheitsmechanismen zu erhalten, soll untersucht werden, ob Lysosomen von Zellen, in denen CLN6 defekt ist, eine andere Proteinzusammensetzung aufweisen als die Lysosomen gesunder Zellen. Der Arbeitsplan des hier dargestellten Vorhabens beginnt mit der Herstellung von DNA-Konstrukten von CLN6 und der die anschließenden Expression des CLN6 Proteins in Zellen. Darauf folgt die Identifikation von CLN6-Interaktionspartnern mittels Massenspektrometrie sowohl aus der gesamten Zelle als auch spezifisch aus einer Fraktion isolierter Lysosomen. Die identifizierten Interaktionspartner werden näher untersucht und die Interaktion mit unabhängigen Methoden bestätigt, bevor eine Untersuchung ihrer funktionellen Bedeutung erfolgt. Zum Vergleich der Proteinzusammensetzung von Lysosomen aus CLN6-defizienten und Kontrollzellen muss zunächst eine entsprechende Zelllinie durch die CRISPR-Cas Technologie generiert werden, danach werden isolierte Lysosomen aus den Zellen massenspektrometrisch verglichen.

Die Enzymersatztherapie (ERT) ist eine anerkannte Therapieform für die Behandlung von lysosomalen Speichererkrankungen. Einer der wesentlichen Charakteristika der neuronalen Ceroidlipofuszinosen (NCLs) ist ein Defekt im lysosomalen Proteinabbau, die zu einer Akkumulation von autophagozytotischen Vakuolen in Neuronen führt. Das präklinische CLN10 Model (Cathepsin D-defiziente Mäuse) zeigt alle NCL-typischen Pathologien. Es ist geplant, rekombinantes humanes Cathepsin-D herzustellen und dieses zunächst in verschiedenen Mengen Cathepsin-D-defizienten Zellen zu verabreichen. Die Aufnahme des Enzyms soll biochemisch und zellbiologisch charakterisiert werden. Dies wird wichtige Informationen liefern, eine spätere Enzymgabe im Mausmodell entsprechend zu optimieren. Danach soll die Gabe des Enzyms an Cathepsin-D-defiziente Mäuse erfolgen um die Verträglichkeit, die Dosis, die Stabilität im Serum, die Anwesenheit und Reifung des Enzyms in verschiedenen Geweben zu untersuchen. Ein wichtiger Aspekt wird es sein, zu untersuchen, ob die therapeutische Gabe des Enzyms auch zu einer verlängerten Lebenszeit der Mäuse führt. Die mögliche Korrektur der Blindheit der Mäuse und des Anteils der Autophagie-Vakuolen wird  ein weiterer Fokus der Untersuchungen sein. Das übergeordnete Ziel ist die Etablierung einer Enzymersatztherapie zur Behandlung einer NCL-Erkrankung und der "proof-of-principle" Nachweis, dass eine Behandlung mit rekombinanten Cathepsin-D zu einer Verbesserung der zellulären und klinischen Problematik in Cathepsin-D-defizienten Mäusen führt. In vier Arbeitsphasen soll das Enzym produziert werden, die Aufnahme und Halblebenszeit des rekombinanten Enzyms in zellulären Systemen getestet werden, die Aufnahme, Halblebenszeit und Gewebeverteilung des Enzyms nach Injektion in Cathepsin-D-defiziente Mäuse getestet werden und eine mögliche Korrektur der Pathologien in den Cathepsin-D-defizienten Mäusen nach Enzymgabe untersucht werden.