Der Focus von TP A7 liegt auf mit Colitis assoziierten PID. Am Klinikum der Universität München sind zwei Teilprojekte ansässig. Teilprojekt A1 ist die Koordinationseinheit des PID-NET-Konsortiums. Teilprojekt A7 hat die Entwicklung einer Stammzellgentherapie für Patienten mit PID und Colitis zum Ziel. In drei Arbeitspakten sollen neue Vektoren für hämatopoetische Stammzell- und intestinale Epithelzell-Therapien für definierte Colitis-assozieerte PID-Varianten entwickelt und charaktierisiert werden. Die SIN-Vektoren sollen in geeigneten Mausmodellsystemen sowohl auf ihre Toxizität als auch ihre Effizienz hin verglichen und einem in vitro Immortalisierungs-Assay unterzogen werden. Die Umsetzbarkeit und Effizienz einer intestinalen Epithelzell-Gentherapie sollen schließlich in einem murinen Modellorganismus geprüft werden.

Die Analyse (schwerer) kombinierter Immundefekte ([S]CID) hat einen erheblichen Beitrag zum Verständnis des humanen Immunsystems geleistet. Gegenwärtig sind ca. 20 Gene bekannt, deren Defekt eine humane (S)CID-Erkrankung verursachen kann. Eine erhebliche Anzahl von (S)CID-Patienten verbleibt jedoch ohne molekulare Diagnose obwohl abhängig vom Immunophänotyp alle in Frage kommenden Gene untersucht wurden. In Zusammenarbeit mit einer Mehrzahl deutscher Immundefektzentren wollen wir neue (S)CID-Patienten auf der Basis klinischer und immunologischer Daten identifizieren. Nach Ausschluss der Patienten, die einen bekannten Defekt tragen, werden wir durch Kandidatengensequenzierung, durch Homozygotiekartierung und Exom-/Genomsequenzierung bei ausgewählten, unklaren SCID-Fällen die molekulare Basis der Erkrankung klären. Die Natur des Gens und seines kodierten Proteins geben dann vor, mit welcher weiteren Methodik die molekulare Pathophysiologie aufgeklärt werden kann. Arbeitsschritte sind: Identifikation von (S)CID-Patienten aus der Patientenklientel der PID-NET Netzwerkteilnehmer und der (S)CID-Datenbank auf der Basis klinischer, immunologischer und molekularer Analysen; Genomische DNA-Sequenzierung zum Ausschluss bekannter Gendefekte; Identifikation neuer molekularer Defekte bei unklaren (S)CID-Fällen basierend auf der Analyse von Kandidatengenen sowie auf der Analyse von Homozygotie Kartierungen und durch Exom-/Genomsequenzierung; Ausarbeitung der molekularen Pathophysiologie dieser (S)CID-Fälle an geeigneten Zell- und Tiermodellen.

Das Universitätsklinikum Freiburg übernimmt in diesem Verbund die Aufgabe, das nationale Register für Primäre Immundefekte (PID) fortzuführen und auszubauen. Außerdem ist die Untersuchung der genetischen und immunologischen Variabilität bei Autoimmun Lymphoproliferativem Syndrom (ALPS) Gegenstand eines Forschungsprojekts. Das deutsche PID-Register wird im Rahmen der existierenden europäischen ESID-Datenbank fortgeführt. Das nationale Register ist dabei strukturell so eingebettet, dass sowohl in Deutschland als auch europaweit mit den Daten gearbeitet werden kann. Ein zentraler Dokumentar organisiert die Dateneingabe in den deutschen Immundefektzentren und übernimmt in vielen Zentren die Dateneingabe vor Ort. Ein Statistiker ist für die Auswertung der Daten verantwortlich und unterstützt die Zusammenarbeit mit anderen Teilprojekten. Ziel des Projektes ist ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen von Lymphoproliferation und Autoimmunität sowie eine verbesserte Diagnosestellung und Therapieüberwachung für die betroffenen Patienten. Zum einen sollen Biomarker  für die Verlaufs- und Therapiekontrolle von ALPS-Patienten mit FAS-Mutation evaluiert werden. Innerhalb der Gruppe von Patienten mit unbekannter Ursache für ihre Erkrankung soll ein diagnostischer Algorithmus entwickelt und neue zugrundeliegende Defekte identifiziert werden. Im Weiteren soll bei Patienten mit FAS-Mutationen die aberrante Differenzierung der doppelt negativen T-Zellen (DNT) analysiert werden.

Hauptziel des Vorhabens ist die Aufklärung des Beitrags von Pro-Caspase-1 Varianten mit reduzierter enzymatischer Aktivität zum autoinflammatorischen Phänotyp von Patienten mit rekurrierenden Fieberepisoden und generalisierter Entzündung. Es wird  ein besseres Verständnis des Einflusses der Pro-Caspase-1 Varianten auf den pro-inflammatorischen Zelltod (Pyroptose), die Autophagie-Mechanismen und Typ 1 Interferon Produktion nach Aktivierung des Toll-artigen Rezeptors (TLR) erwartet. Außerdem werden neue Einsichten in die molekularen Mechanismen, die autoinflammatorischen Erkrankungen zu Grunde liegen, die nicht durch erhöhte IL-1beta Freisetzung verursacht sind, erwartet. Die Ergebnisse werden möglicherweise diagnostische und therapeutische Ansätze verbessern. Die Arbeitspakete (WP) beinhalten folgende Untersuchungen: (WP 1) Einfluss der Pro-Caspase-1 Varianten auf den proinflmmatorischen Zelltod (Pyroptose). Die Pyroptose wird durch 7-Aminoactinomycin (7-AAD) Färbung und Messung von Laktatdehydrogenase (LDH) bestimmt. Zytokine werden durch "cytometric bead arrays" quantifiziert. (WP 2) Der Einfluss der Pro-Caspase-1 Varianten auf Autophagie wird mit Western Blots einer Form des Protein (LC3 II) des "microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta (LC3 I)" untersucht. (WP 3) Einfluss der Pro-Caspase-1 Varianten auf die Typ1 Interferon Antwort. Die Transkription von IFNbeta wird mit quantitativer RT-PCR mittels "TaqMan" Technologie (delt/deltaCT) quantifiziert. WP 3 Einfluss der Pro-Caspase-1 Varianten auf die Typ1 Interferon Antwort Transkription von IFNbeta wird mit qRT-PCR mittels TaqMan Technologie(delt/deltaCT) quantifiziert.

Ziel des Teilprojektes A5 ist die Identifizierung neuer angeborener Immundefekte mit Prädisposition zu schweren bakteriellen Infektionen auf genetischer, immunologischer und klinischer Ebene. In der Weiterentwicklung der Zielsetzung aus der vorherigen Förderperiode wird sich die Arbeit nicht nur auf Patienten mit invasiven, sondern auch auf Patienten mit schweren (=lebensbedrohlichen) bakteriellen Infektionen konzentrieren. Ein besonderer Fokus der Arbeit wird auf Patienten mit Erkrankungsbeginn in der Neonatalzeit, der Säuglings- und der Kleinkindzeit liegen. Die Arbeit baut auf einer Kohorte von mehr als 350 Patienten mit schweren bakteriellen Infektionen auf, die seit 2008 an der Charité untersucht worden sind. Es werden nach einem Kandidatengenansatz diese Patienten weiterhin zunächst funktionell auf Defekte in Toll-like und Interleukin-1 Rezeptor abhängigen Signalwegen untersucht. Ausgewählte Patienten mit besonders ausgeprägter Infektionsanfälligkeit werden mit whole-exome Ansätzen hypothesenfrei untersucht. Eine deutschlandweite Kohorte von > 150 Kindern mit stattgehabter invasiver bakterieller Infektion wird zunächst immunologisch phänotpyisiert. Bei eindeutigen immunologischen Phänotypen erfolgt anschließend die gezielte Sequenzierung nach einem Kandidatengenansatz, ansonsten wir bei ausgewählten Patienten mit besonderss eindrücklichem klinischen Phänotpy (frühere Erkrankungsbeginn, rezidivierender Verlauf) ein whole exome sequencing durchgeführt. In einem Unterprojekt wird die pathophysiologische Relevant von anti-IL6 Antiköropern für die Entwicklung von invasiven bakteriellen Infektionen untersucht.

Neue Patienten-abgeleitete Plattformen zur Modellierung von Erkrankungen und der damit verbundenen Therapieentwicklungen sind gerade im Fall seltener Erkrankungen von enormer Bedeutung, da hier zugängliches Patientenmaterial nur limitiert vorliegt. Hier stellen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) eine wertvolle, unerschöpfliche Quelle für patienten- und krankheitsspezifische autologe Zellen zum Screening neuer Medikamente und zur Validierung neuer Therapiestrategien dar. Ziel des Projektes ist es, für PID neue iPSC-Krankheitsmodelle zu kreieren, mit deren Hilfe neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und Therapie erzielt werden können. Zur Entdeckung neuer Behandlungsmethoden sollen mit Hilfe von CRISPR/Cas9 RNA-gesteuerten Nukleasen neue, PID-relevante Mutationen oberhalb und unterhalb der gleichen Signaltransduktionskaskade eingeführt werden und die Pfade durch "small Molecules" moduliert werden. Ferner sollen die ursächlichen Gendefekte PID-spezifischer iPSC korrigiert werden durch „Silencing"-resistente retrovirale/lentivirale Vektoren bzw. alternativ gezieltes Genome Editing durch CRISPR/CAS9 und homologe Rekombination. Der Arbeitsplan gliedert sich in drei Work Packages (WP). WP1: Patienten-spezifische iPSC-Generierung und Krankheitsmodellierung. Hier werden humane Patienten-spezifische iPSC durch unsere effiziente lentivirale Reprogrammierungsplattform erstellt und detailliert im Hinblick auf Pluripotenz, Differenzierungsverhalten und PID-Phänotyp analysiert. WP2: iPSC Knock out Modelle. Als Alternative zu WP1 ist geplant, mittels CRISPR/Cas9 definierte PID-relevante Mutationen einzuführen und ein Vergleich mit Patienten- und gesunden Spenderzellen. Weiterhin werden auch Kombinationen von verschiedenen Mutationen eingeführt und validiert. WP3: Modellierung von Therapieansätzen. In diesem WP werden nach hämatopoetischer Differenzierung von PID-iPSC neue Small Molecule- und Gentherapie- sowie Genome Editing-Ansätze getestet.