Das Teilprojekt 1 dient der Koordination des Konsortiums. In dem Teilprojekt wird die Zusammenarbeit der Projekte koordiniert, die Patientendatenbank gepflegt und bioinformatische und statistische Analysen, z.T. mit neu zu entwickelnden Algorithmen durchgeführt. Im Teilprojekt 2 werden Patienten mit bekannten Imprintingerkrankungen im Detail untersucht. Zur Identifizierung von Imprinting-Center-Mutationen, die das genomische Imprinting beeinflussen, sollen mittels hoch-paralleler Sequenzierung die entsprechenden Regionen für Angelman-Syndrom, Beckwith-Wiedemann-Syndrom, Silver-Russell-Syndrom, upd(14)-Syndrome und Transienten Neonatalen Diabetes Mellitus sequenziert werden. Durch eine Exom-Sequenzierung sollen trans-wirkende Gene identifiziert werden. Diese Untersuchung wird an Patienten mit Angelman-Syndrom mit und ohne somatisches Mosaik für einen Imprintingdefekt, an Patienten mit Beckwith-Wiedemann- oder Silver-Russell-Syndrom und Multimethylierungsdefekten und in einer Familie mit rekurrenten Imprintingdefekten der Imprintingkontrollregion 2 auf Chromosom 11p15 durchgeführt. Weiterhin soll über einen Vergleich von Expressionsprofilen die molekulare Grundlage von gemeinsamen klinischen Merkmalen bei Prader-Willi- und upd(14)mat-Syndrom identifiziert werden. Folgende Arbeitsschritte sind geplant: Rekrutierung von Patienten mit PWS, AS, BWS, SRS oder upd(14)-Syndrom und einem Imprinting-Defekt. Klinische Evaluation und molekulargenetische Klassifizierung (Monat 1-36).  Methylierungsanalyse mittels hochparalleler Sequenzierung an Bisulfit-behandelter DNA für das gesamte Netzwerk (Monat 1-36).  Sequenzierung der IC-Regionen und Exome durch hochparallele Sequenzierung (Monat 1-30).  RNAseq an Fibroblasten und IPSCs von PWS und upd(14)mat-Syndrom (Monat 18-36).

In diesem Vorhaben wird Teilprojekt 3a bearbeitet: Molekulare Veränderungen in der chromosomalen Region 11p15.5d führen entweder zum Silver-Russell- oder zum Beckwith-Wiedemann-Syndrom (SRS, BWS). Dabei werden fortlaufend neue Mutationen und Epimutationen bei Patienten identifiziert, so dass das molekulare Spektrum derzeit noch nicht vollständig erfasst ist. Die bisherigen Arbeiten der Projekteilnehmer haben gezeigt, dass bei den beiden Erkrankungen, aber auch den anderen Imprintingerkrankungen, nicht nur spezifische Genorte betroffen sind, sondern auch allgemeine Methylierungsstörungen auftreten können. Die funktionellen Konsequenzen der einzelnen, aber auch der allgemeinen Störungen sind derzeit meist unklar. Die Charakterisierung dieser molekularer Veränderungen und die Identifizierung neuer Befunde bei SRS und BWS ist daher nicht nur die Grundlage für das Verständnis ihrer Pathoätiologie, sie ist auch Voraussetzung für eine effiziente Diagnostik und neue personalisierte Therapieansätze. Im geplanten Projekt sollen daher zum einen die diagnostischen Algorithmen verbessert werden, mit ihrer Hilfe sollen dann weitere Patienten charakterisiert und bisher unbekannte molekulare Defekte und ihre Interaktionen identifiziert werden. Folgende Arbeitsschritte sind geplant: Erfassung von Patienten mit ungewöhnlichen/neuen molekularen Veränderungen, Entwicklung und Validierung eines Multilocus-MS-MLPA-Ansatzes; Entwicklung eines zielgerichteten MS-NGS-Ansatzes; NGS-Verfahren bei Patienten mit 11p15-Imbalancen und ICR1-Hypomethylierung.

Die mit der chromosomalen Region 11p15.5-assoziierten Imprinting-Erkrankungen (IDs) Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS) und Silver-Russell Syndrom (SRS) sind charakterisiert durch komplexe Wachstumsdefekte mit variablem klinischen Bild. Die zur Zeit verwendeten diagnostischen Vorgehensweisen lassen aufgrund niedrig-mosaikaler epigenetischer Defekte, derzeit unbekannten genetischen Veränderungen regulatorischer Bereiche in 11p15.5 sowie in weiteren chromosomalen Regionen eine erhebliche Anzahl der Patienten ohne molekulare Diagnose. Im Teilprojekt 3 soll daher der vorhandene diagnostische Algorithmus weiter ausgeweitet und optimiert werden. Mit dem Teilprojekt 3b soll dadurch gleichzeitig herausgefunden werden, wie sich gefundene Veränderungen funktionell auf die Transkription geprägter Gene auswirken, bzw. wie sie sich gegenseitig beeinflussen. Sowohl die Identifizierung der molekularen Veränderungen bei SRS und BWS als auch deren funktionelle Charakterisierung ist die Grundlage für das Verständnis der Pathoätiologie und Voraussetzung für eine effiziente Diagnostik sowie neue personalisierte Therapieansätze. Arbeitsschritte sind: Erfassung von Patienten mit ungewöhnlichen/neuen molekularen Veränderungen; Analyse deregulierter geprägter Gene bei Imprintingerkrankungen mit MLID Potenzial; Funktionelle Analysen von (Epi)-Mutationen, die mittels der in Aachen (TP3a) etablierten NGS-Ansätze identifiziert wurden; Nachweis von trans-Effekten von Schlüssel-Faktoren.

Teilprojekt 4 sammelt Proben von Patienten mit Störungen der elterlichen Prägung (Imprinting) an mehreren Genen. Um die Bedeutung der beiden häufig von Prägungsstörungen betroffenen Gene ZDBF2/GPR1 und FAM50B für Patienten mit mehrfachen Imprinting-Störungen zu untersuchen, werden bis zu 500 Patienten analysiert. Zudem stellt Teilprojekt 4 dem Konsortium technische Plattformen für (epi)genetische Analysen zur Verfügung. Als Grundlage zur epigenetischen Charakterisierung von Imprinting-Störungen wird von bis zu fünf Patienten mit Imprinting-Störungen die Struktur der DNA und der mit ihr assoziierten Proteine sowie die Interaktion des Proteins CTCF mit der DNA in verschiedenen Geweben (z. B. Blut-, Haut- und pluripotente Stammzellen) nach den Standards des Internationalen Epigenom Projektes katalogisiert. Teilprojekt 5 verfolgt einen therapeutischen Ansatz mit dem Ziel, Imprinting-Störungen direkt mittels einer gerichteten Modifikation der DNA-Methylierung zu korrigieren. Grundlage hierfür sind die bereits etablierten Stammzellen von Patienten mit Imprinting-Störungen. Es sollen Proteine (CRISPR/cas9 Komplexe) an spezielle Enzyme gekoppelt werden und in diese Zellen transfiziert werden. Durch die Korrektur des fehlerhaften Methylierungsmusters von Patienten mit Imprinting-Störungen in Zellkulturen sollen innovative Ansätze zur Behandlung bisher unheilbarer epigenetischer Erkrankungen erarbeitet werden. Arbeitsschritte sind: Klinische und molekulare Charakterisierung von Patienten mit MLID/MLID+; Evaluierung von Imprinting-Störungen unter Beteiligung der ZBDF2/GPR1 und FAM50B loci; Chromatin Analysen; Konstruktion von CRISPR/Cas9 Konstrukten und guideRNAs; CRISPR/Cas9 gekoppelte Methylierung in Zelllinien; Transfektion-Optimierung; Transfektion und Methylierungsanalyse; Analyse der Expressions- und Epigenomveränderungen; Analyse von iPSC abgeleiteten Zellen.

Teilprojekt 4 sammelt Proben von Patienten mit Störungen der elterlichen Prägung (Imprinting) an mehreren Genen. Um die Bedeutung der beiden häufig von Prägungsstörungen betroffenen Gene ZDBF2/GPR1 und FAM50B für Patienten mit mehrfachen Imprinting-Störungen zu untersuchen, werden bis zu 500 Patienten analysiert. Zudem stellt Teilprojekt 4 dem Konsortium technische Plattformen für (epi)genetische Analysen zur Verfügung (Array- und Sequenzierungs-basierte Verfahren). Als Grundlage zur epigenetischen Charakterisierung von Imprinting-Störungen wird von bis zu fünf Patienten mit Imprinting-Störungen die Struktur der DNA und der mit ihr assoziierten Proteine (Chromatinstruktur und bis zu 6 Histonmodifikationen) sowie die Interaktion des Proteins CTCF mit der DNA in verschiedenen Geweben (z.B. Blut-, Haut- und pluripotente Stammzellen) nach den Standards des Internationalen Epigenom Projektes katalogisiert. Folgende Arbeitspakete werden bearbeitet: Arbeitspaket 4.1: Klinische und molekulare Charakterisierung von Patienten mit MLID/MLID+; Abeitspaket 4.2: Evaluierung von Imprinting-Störungen unter Beteiligung der ZBDF2/GPR1 und FAM50B loci und Arbeitspaket 4.3: Chromatin Analysen.

Ziel dieses Projekts ist es, die fehlerhafte DNA-Methylierung bei Imprintingerkrankungen zu korrigieren. Hierzu werden sogenannte DNA-Methyltransferasen eingesetzt, Enzyme die Methylgruppen auf die DNA übertragen. Diese sollen durch Zinkfingerproteine gezielt an die DNA-Stellen im Genom gebracht werden, an denen die DNA-Methylierung korrigiert werden muss. Solche Zinkfingerproteine sollen eingesetzt werden, weil ihre DNA-Bindungsspezifität artifiziell entwickelt werden kann. Es werden im Zuge des Projekts Zinkfingerproteine erzeugt, die spezifisch an den Prader/Willi- und Angelmann Syndrom Locus binden. Die Bindung wird präferentiell an die DNA-Sequenzen gerichtet, in denen der DNA-Methylierungsdefekt bei Patienten mit Imprintingerkrankungen auftritt. Falls die Adressierung an den Prader/Willi- und Angelmann Syndrom Locus nicht erfolgreich ist, soll alternativ wird auch mit dem Beckwith/Wiedemann- und Silver/Russel-Syndrom Locus gearbeitet werden. Die Bindung der Zinkfingerproteine an die Zielregionen soll verifiziert werden. Dafür kommt eine als Chromatin Immunpräzipitätionsexperiment bezeichnete Methode zum Einsatz, die es erlaubt, die Bindung von Proteinen an DNA genomweit zu untersuchen. Die so hergestellten Zinkfingerproteine werden anschließend mit DNA-Methyltransferasen fusioniert, um die Zielregionen zu methylieren und damit den Methylierungsdefekt zu korrigieren. Um die Zinkfingerprotein-Methyltransferase Konstrukte in Zellen einzubringen, werden verschiedene Methoden erprobt. Anschließend werden die Änderungen der DNA-Methylierung in beiden Allelen unter Verwendung der Ressourcen des Konsortiums untersucht. Bei erfolgreicher Methylierung der Zielregionen wird die allelspezifische Genexpression der entsprechenden geprägten Gene analysiert.