Die Ziele der Teilprojekte sind einerseits die effiziente wissenschaftliche und administrative Koordination des gesamten Forschungsverbundes (Teilprojekt SP C) einschließlich der Organisation von Meetings und Telefonkonferenzen sowie der Erstellung von Evaluationen, wissenschaftlichen Berichte und Veröffentlichungen. Geplant sind regelmäßige Telefonkonferenzen und jährliche Meetings des Konsortiums. Internationales Networking wird dabei aktiv gesucht und unterstützt. Andererseits wird im Teilprojekt SP A4 die intratumorale Heterogenität des Neuroblastoms mit Hilfe aktueller molekularer Sequenziertechnologien untersucht, da die molekulare Heterogenität von Tumoren und die resultierende klonale Evolution von Rezidiven eines der größten Behandlungsprobleme bei Krebserkrankungen darstellt. Dieses Phänomen wurde beim Neuroblastom bislang noch nicht untersucht und soll daher Gegenstand dieses Projekts sein. Der Arbeitsplan enthält die Untersuchung von humanen und murinen Neuroblastomproben mit Hilfe der Whole Genome und Whole Exome Sequenziertechnologie und weiteren Hochdurchsatztechnologien in den Bereichen der RNA Sequenzierung und Proteomik. Das molekulare Profil primärer Tumorproben soll dabei vor allem mit dem Profil der Metastasen und Rezidive verglichen werden, um prognoserelevante Genveränderungen von sekundären, weniger wichtigen Genveränderungen unterscheiden zu können. Die identifizierten Gene sollen als neue Biomarker validiert und funktionell charakterisiert werden.

Das Neuroblastom ist eine Krebserkankung, von der etwa eines von 5000 Kindern betroffen ist. Die systematische und integrierte Datenauswertung von Hochdurchsatzdaten zur Vertiefung des Wissens über die Neuroblastom-Entstehung und -Progression ist ein zentraler Baustein für die Verbesserung der Lebenserwartung von Neuroblastom-Patienten. Bisherige Aktivitäten in der molekularen Charakterisierung von Neuroblastomen mittels molekularer Hochdurchsatzverfahren haben potenzielle Zielstrukturen für innovative Therapien geliefert und eine umfangreiche Datenmenge, die bei entsprechender Auswertung eine Optimierung der Risikostratifizierung von Patienten erlauben wird. Den Arbeiten liegt einen umfassender systemmedizinischer Ansatz für das Neuroblastom zugrunde, der sowohl eine innovative Datenauswertungsstrategie bereits bestehender Datensätze als auch eine systembiologische Modellierungsstrategie beinhaltet. Dabei wird das DKFZ in vier Teilprojekten federführend beteiligt sein: SPA1. Datenintegration - Netzwerk, Cross-Plattform und Cross-Entitäten Analyse, SPA3. Protein-Expressionsprofile von Neuroblastom-Subtypen, SPB1. Epigenetische Kontrolle der transkriptionellen Aktivität von MYC Proteinen, 4. Netzwerk-Analyse von durch Histondeacetylasen (HDAC) kontrollierten micro RNAs im Neuroblastom. Es wird erwartet, dass ein besseres Verständnis der für die Neuroblastom Pathogenese verantwortlichen Signalnetzwerke zu neuen, gezielten und effektiveren Therapiestrategien für Hochrisiko-Neuroblastomen führt. Hieraus soll eine präzisere Auswahl von Patienten-Subgruppen anhand des individuellen Risikos und molekularer Biomarker-Profile entstehen.

Am Standort Essen werden zwei Teilprojekte (SPs) durchgeführt, in denen genetische Modelle, Cross-Spezies-Analysen und Metabolomanalysen durchgeführt werden, um neue Therapieansätze für das Neuroblastom und ggf. weitere Krebs-Entitäten zu finden. Im SP A2 sollen aufbauend auf existierenden Pipelines Hochdurchsatzdaten aus humanen Tumoren mit denen aus experimentellen Maustumoren verglichen werden. Dazu werden Softwareplattformen als auch von Partnerinstituten entwickelte Lösungen genutzt und ggf. optimiert. Im SP B3 werden biochemische Assays zum Primärzuckerstoffwechsel in präklinischen Neuroblastomsystem etabliert. In enger Kooperation mit dem MDC Berlin, wird die Modellierung des Zuckerstoffwechsels sowie die therapeutische Intervention experimentell überprüft und validiert.

Die Vorhabenziele sind: 1. Verbesserung der Risiko-Vorhersage der Patienten auf der Basis der molekularen Eigenschaften individueller Tumoren. 2. Entwicklung neuer Therapien, die gezielt in aberrante Signalwege der Krebszellen eingreifen. Das Neuroblastom ist ein maligner Tumor des Kindesalters mit äußerst variablen klinischen Verläufen. Neuroblastom-Patienten der Hochrisikogruppe haben auch heute noch eine schlechte Überlebenschance. Neue Behandlungsformen für diese Patienten werden daher dringend benötigt. Studien unserer und anderer Arbeitsgruppen haben jedoch gezeigt, dass dem Neuroblastom eine enorme genetische Vielfalt zu Grunde liegt, was die Abgrenzung molekular-definierter Tumorsubgruppen sowie die Entwicklung neuer, gezielter Therapiestrategien erheblich erschwert. In dem geplanten Projekt A1 möchten wir daher existierende genetische, epigenetische und transkriptomische Hochdurchsatzdaten in bioinformatischen Netzwerkanalysen integrieren, um auf diese Weise biologisch und klinisch relevante Neuroblatom-Subgruppen zu identifizieren. Für einen Teil der Hochrisiko-Neuroblastome vermuten wir auf der Basis bestehender genetischer Daten, dass ein aberrant aktivierter RAS-Signalweg zur malignen Transformation der Zellen beiträgt. In dem geplanten Projekt B2 möchten wir daher diese Hypothese durch in vitro und in vivo Untersuchungen experimentell prüfen. Diese Arbeiten sollen die Grundlage für die Entwicklung neuer Behandlungsformen sein, die gezielt den RAS-Signalweg inhibieren.

Folgende Arbeiten sollen im Rahmen des Teilprojkets SP A2 durchgeführt werden: In Neuroblastomen mit Amplifikation des Onkogens MYCN finden sich oft zusätzliche onkogene Mutationen („Ko-Mutationen"), die u.a. den RAS Signalweg aktivieren. Es kann angenommen werden, dass funktionell wichtige Mutationen über Speziesgrenzen hinweg auftreten. Wir möchten daher durch die Spezies-übergreifende Analyse von humanen, MYCN amplifizierten Neuroblastomen, und murinen Neuroblastomen, die in Mäusen entstehen, die durch genetische Manipulation MYCN überexpremieren, die Ko-Mutationen mit der höchsten Relevanz für die Neuroblastomentstehung identifizieren und fuktionell analysieren. Es werden genetisch veränderte Mäuse gezüchtet, die MYCN oder MYCN/RAS in der Neuralleiste expremieren. Entstehende Neuroblastome werden asserviert, zusätzlich werden Zellinien etabliert. Die Neuroblastome werden mittels Hochdurchsatzverfahren untersucht, die Daten mir humanen Neuroblastomen verglichen, funktionelle Untersuchungen an den Zelllinien durchgeführt.

Im Rahmen des Vorhabens werden die Teilprojekte SP A3 und SP B3 durchgeführt. SP A3: Transkriptionale Signaturen sind nicht immer ausreichend, um biologische Treiber der Pathogenese zu identifizieren. Solche Genexpressionsdaten zeigen nicht, in welchem Umfang mRNAs in Proteine translatiert werden. Im Projekt A3 verwenden wir einen Proteomik-Ansatz, um menschliche Neuroblastom-Proben auf Protein-Ebene direkt zu studieren. Wir verwenden dazu eine Methode, um menschliche Tumor Proteome genau zu quantifizieren. Dazu wird Tumor-Gewebe mit repräsentativen Zelllinien vermischt, das über stable-isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) markiert wurde. Dieser sogenannte Super-SILAC Ansatz dient dabei als interne Referenz für die relative Quantifizierung der verschiedenen Tumorproben. Wir vergleichen dabei jeweils Proben aus drei Kategorien: (A) geringes Risiko, (B) hohes Risiko heilbar, (C) hohes Risiko nicht-heilbar. Wir werden untersuchen, ob Proteom Signaturen die bestehenden klinischen und genomische Neuroblastom-Einstufung und Risiko-Stratifikations Systeme sinnvoll erweitern. SP B3: Ziel des Projektes ist die Modellierung des primären Zuckerstoffwechsels in Neuroblastom-Zellen zur Identifizierung optimaler therapeutischer Intervention. Es soll ein mathematisches Modell der Glykolyse entwickelt werden, welches die verschiedenen experimentellen Bedingungen beschreibt, darüber hinaus werden der Zitratzyklus und die zellulären Atmungsprozesse einbezogen. Die entwickelten Modellvarianten sollen um die relevante Genexpression erweitert, und zur Berechnung sowie den Vergleich von Flüssen und kritischen Konzentrationen unter den verschiedenen Bedingungen genutzt werden. Nachfolgend werden Sensitivitätsanalysen durchgeführt, die die Identifizierung und den Vergleich kritischer Prozesse und Regulationen erlauben. Für die verschiedenen Bedingungen werden umfassende Simulationen kombinatorischer Inhibitionen des glykolytischen Systems durchgeführt.

Das Ziel des Vorhabens ist die Identifizierung von Genen, die für den Zellzyklusarrest und die Differenzierung neuronaler Progenitorzellen entscheidend sind. Es wird davon ausgegangen, dass die diesen Prozessen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen in Neuroblastomen gestört sind. Ihre Identifizierung sollte daher Angriffspunkte für neue Therapiemöglichkeiten für die bei Kindern relativ häufige Krebserkrankung Neuroblastom bieten. Grundlage des Projektes ist ein small hairpin RNA (shRNA)-Screen, der in Neuroblastomzellen durchgeführt wird. Dabei wird nach Genen gesucht, die die Antwort dieser Zellen auf die Zugabe von Retinsäure beeinflussen. Dazu werden Zellen mit einer komplexen, lentiviralen shRNA-Bibliothek infiziert und dann in der Abwesenheit und Anwesenheit von Retinsäure inkubiert. Nach einigen Generationen werden aus den überlebenden Zellen die shRNA-Sequenzen reisoliert und mit Hilfe von Hochdurchsatzsequenzierung deren Repräsentation in der Population bestimmt. Der Vergleich mit den Änderungen relativ zur Ausgangspopulation und zur Kontrollpopulatin identifiziert diejenigen shRNAs, die spezifisch die zelluläre Antwort auf Retinsäure beeinflussen. Im zweiten Schritt werden mit bioinformatischen Methoden und in der Kooperation mit den Gruppen dieses Netzwerkes die zugrunde liegenden regulatorischen Netzwerke identifiziert und die sich daraus ergebenden kausalen Hypothesen getestet.